微生物限度檢驗方法驗證方案

◆適用范圍

本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。

◆目的

通過驗證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定 。

◆職責(zé)

項目責(zé)任人：負(fù)責(zé)驗證方案的起草及具體實施。

驗證管理員：負(fù)責(zé)驗證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。

QA現(xiàn)場監(jiān)控員：負(fù)責(zé)驗證實施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。

QC負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)驗證方案中檢驗方法的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標(biāo)準(zhǔn)檢驗操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)行，負(fù)責(zé)組織實施。

QC檢驗員：負(fù)責(zé)驗證方案的起草與參與實施，并對所測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。

質(zhì)量部經(jīng)理：負(fù)責(zé)驗證方案及報告的審核和批準(zhǔn)。

 1.內(nèi)容

1.1.概述

通過驗證以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定；確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進(jìn)行試驗，根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，按驗證的方法和條件進(jìn)行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進(jìn)行驗證，直至驗證結(jié)果符合設(shè)立的驗證標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進(jìn)行。

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1.2.1.驗證用菌株及菌種要求

大腸埃希菌【CMCC（B）44102】

金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】

枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】

黑曲霉【CMCC（F）98003】

白色念珠菌【CMCC（F）98001】

大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，前述菌株作為細(xì)菌計數(shù)驗證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計數(shù)驗證用菌株。

驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。

1.2.2.驗證菌菌液制備

1.2.2.1. 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃ 培養(yǎng)18～24小時。取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數(shù) 50～100cfu的菌懸液。

1.2.2.2.白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng) 24～48小時；取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數(shù) 50～100cfu的菌懸液。

1.2.2.3.接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。

1.2.3. 供試液的制備

1.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備

◆稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。

◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。

1.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的制備

當(dāng)供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：

◆ 培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)， 按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。

◆離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。

◆薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。

◆ 中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶Π被郊姿幔亟饘俚乃幬镌谂囵B(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。

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1.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。采用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。

1.2.5.試驗組

1.2.5.1.平皿法：取試驗可能用的稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。

1.2.5.2.培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。

1.2.5.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。

1.2.5.4. 離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗可能用的稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心 20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。

1.2.6. 供試品對照組

取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同）。

1.2.7.稀釋劑對照組

若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。

1.2.8.回收率計算

1.2.8.1.試驗組回收率計算

試驗組的菌回收率＝ 試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數(shù) ×100%

菌液組的平均菌落數(shù)

1.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算

試驗組的菌回收率＝ 稀釋劑對照組平均菌落數(shù) ×100%

菌液組的平均菌落數(shù)

計數(shù)方法驗證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

1.2.8.3. 結(jié)果判斷

在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70%。

1.3. 控制菌檢驗方法驗證

當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢驗方法應(yīng)進(jìn)行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進(jìn)行。

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1.3.1.驗證用菌株

大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】

驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。

1.3.2.菌液制備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時；分別取培養(yǎng)液 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。

1.3.3. 陰性菌對照組 設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。

1.3.4.試驗組

1.3.4.1.常規(guī)法

◆ 大腸埃希菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。

◆大腸菌群 取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml 、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規(guī)定檢查。

◆沙門菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌 10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。

◆銅綠假單胞菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。

◆ 金黃色葡萄球菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。

1.3.4.2. 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強(qiáng)的樣品。

1.3.4.3. 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。

1.3.4.4. 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。

1.3.4.5.中和法 在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對微生物無毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。

1.3.5.結(jié)果判斷

至少應(yīng)進(jìn)行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行該供試品控制菌的檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。

 2.驗證的實施

2.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。

2.2.分析數(shù)據(jù)，綜合整個驗證過程，得出驗證結(jié)論。

2.3.驗證過程中發(fā)生的異常情況，按照《偏差處理程序》進(jìn)行處理。

3.相關(guān)文件

《微生物限度檢查SOP》

4.再驗證

4.1.藥品的組分發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時。

4.2.驗證時檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時。